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                                                              English | 中文版 | 手機(jī)版 企業(yè)登錄 | 個人登錄 | 郵件訂閱
                                                              當(dāng)前位置 > 首頁 > 技術(shù)文章 > ELISA常見問題及解決方案

                                                              ELISA常見問題及解決方案

                                                              瀏覽次數(shù):3279 發(fā)布日期:2016-11-10  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)
                                                               
                                                              一.背景高或者非特異性染色
                                                               
                                                              原因
                                                              解決方案
                                                              抗體的非特異性結(jié)合
                                                              更換封閉液(例如,使用酪蛋白替代BSA);封閉結(jié)束后不要清洗;倒出封閉液,吸水紙上吸干殘留液體后直接進(jìn)行下一步。
                                                              未充分清洗酶標(biāo)板
                                                              確保在清洗過程中每個微孔都充滿緩沖液、清洗儀器正常工作。各步驟之間清洗3~5次,不要增加清洗次數(shù)。清洗完成后,將酶標(biāo)板用力按壓在紙巾上,以除去殘余的緩沖液。清洗溶液中應(yīng)添加適量的Tween-20(推薦濃度0.01-0.1%)。
                                                              緩沖液被污染
                                                              緩沖液應(yīng)新鮮配制,一周內(nèi)使用,并過濾除菌。
                                                              孵育溫度太高
                                                              整個實驗過程應(yīng)在室溫25℃。
                                                              孵育時間過長
                                                              縮短孵育時間
                                                              酶標(biāo)記物污染了底物或者陽性對照污染了微孔
                                                              吸取不同的試劑時應(yīng)更換吸頭,并使用不同的貯液器。最好用移液器加入或去除清洗緩沖液(倒入/倒出可能導(dǎo)致交叉污染)。
                                                              檢測抗體或Avidin-HRP的濃度過高
                                                              檢測濃度計算是否正確,或者進(jìn)一步稀釋后再使用。
                                                              底物在使用前曝光
                                                              在將底物加入到微孔中以前,應(yīng)始終避光保存
                                                              讀取吸光值時使用了錯誤的濾光片
                                                              ABTS為底物時應(yīng)在405nm波長讀取吸光值(TMB為底物時應(yīng)在450nm波長讀取吸光值),并以650nm作為校正波長。
                                                              顯色時間過長
                                                              每5分鐘讀取一次吸光值,以監(jiān)測空白孔的O.D.讀數(shù)。
                                                               
                                                              二.顯色弱或者不顯色
                                                              原因
                                                              解決方案
                                                              遺漏了某種試劑或某個步驟
                                                              查看實驗方案,嚴(yán)格遵循實驗操作步驟。
                                                              清洗緩沖液中的去污劑濃度過高
                                                              去除或降低去污劑的濃度,推薦0.01-0.1%
                                                              酶標(biāo)板未適當(dāng)清洗
                                                              減少各步驟之間的清洗次數(shù),尤其是當(dāng)未使用全自動或半自動洗板機(jī)時,清洗1-2次即可。
                                                              樣本中存在酶抑制劑
                                                              疊氮鈉抑制了過氧化物酶的活性。
                                                              孵育時間或溫度錯誤
                                                              孵育期間應(yīng)將酶標(biāo)板放在孵育箱(25℃)內(nèi),以免出現(xiàn)溫度波動
                                                              加入微孔中的底物量有誤
                                                              檢查移液器
                                                              酶-底物系統(tǒng)不合適
                                                              Avidin-HRP和ABTS配對使用,Streptavidin和TMB配對使用
                                                              試劑盒內(nèi)的組分儲存不當(dāng)
                                                              按說明書要求儲存各組分
                                                              讀取吸光值時使用了錯誤的濾光片
                                                              ABTS為底物時應(yīng)在405nm波長讀取吸光值(TMB為底物時應(yīng)在450nm波長讀取吸光值),并以650nm作為校正波長
                                                               
                                                              三.標(biāo)準(zhǔn)曲線不佳
                                                              原因
                                                              解決方案
                                                              標(biāo)準(zhǔn)品配制有誤
                                                              使用推薦的稀釋緩沖液對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋
                                                              過早稀釋
                                                              使用前再配制各種試劑,并盡快使用
                                                              捕獲抗體無法包被
                                                              使用適合做ELISA的板,不能用細(xì)胞培養(yǎng)板
                                                              清洗不充分
                                                              每個微孔中應(yīng)加入等體積清洗液,確保所有微孔均可被抽吸干凈,并及時填充。
                                                              移液出錯
                                                              校正移液器,快速、等量的將移液器中的試劑沿微孔的側(cè)壁加入
                                                              顯色時間過長
                                                              空白孔的O.D.讀數(shù)不超過0.2或最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品孔的O.D.讀數(shù)不超過1.2。
                                                              試劑盒內(nèi)的組分儲存不當(dāng)
                                                              按說明書要求儲存各組分,不要將重懸后的試劑在室溫放置時間過長。
                                                               
                                                              .精確度較差
                                                              原因
                                                              解決方案
                                                              試劑混合不充分
                                                              移液前,充分混合試劑
                                                              清洗不充分
                                                              每個微孔中應(yīng)加入等體積清洗液,確保所有微孔均可被抽吸干凈,并及時填充。
                                                              移液出錯
                                                              校正移液器,快速、等量的將移液器中的試劑沿微孔的側(cè)壁加入
                                                              耗材重復(fù)使用
                                                              吸取不同樣本時應(yīng)更換吸頭;不同的試劑使用不同的貯液器;個孵育時段內(nèi)應(yīng)用新的密封片封板。
                                                              微孔被吸頭或洗板機(jī)劃傷
                                                              吸液、加液時小心操作
                                                              樣本中存在沉淀物
                                                              使用前應(yīng)離心樣本管
                                                              微孔不干凈或存在污垢
                                                              使用前仔細(xì)檢查微孔,并清除污垢。讀取吸光值前,請擦拭酶標(biāo)板的底部,以去除污垢或指紋。
                                                               
                                                              .邊緣效應(yīng)
                                                              原因
                                                              解決方案
                                                              蒸發(fā)
                                                              每個孵育步驟都應(yīng)使用密封片封板
                                                              溫度不均勻
                                                              孵育期間應(yīng)將酶標(biāo)板放在孵育箱(25℃)內(nèi),以免溫度波動,請勿堆疊酶標(biāo)板。
                                                               
                                                              植物elisa試劑盒大全:http:///cn/tech/2013/8-15/tech_57126682.htm
                                                               
                                                              來源:北京啟維益成科技有限公司試劑部
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