DNA甲基化測(cè)序后的后期驗(yàn)證方法介紹
做完測(cè)序后，如果需要對(duì)分析結(jié)果中感興趣的內(nèi)容進(jìn)行后期驗(yàn)證，則需要進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。DNA甲基化研究的后期驗(yàn)證包括簡(jiǎn)單驗(yàn)證、全基因組甲基化干擾實(shí)驗(yàn)（非靶向）、靶向目標(biāo)基因的甲基化/去甲基化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等。
一、簡(jiǎn)單驗(yàn)證
二、全基因組甲基化干擾實(shí)驗(yàn)（非靶向）
ü DNA甲基化抑制劑
阿扎胞苷（5-Aza）能夠通過(guò)與DNA甲基化酶DNMT蛋白家族形成共價(jià)鍵抑制其酶活性，使細(xì)胞的DNA甲基化水平降低。
ü DNA斑點(diǎn)雜交（定性）
ü 比色法（定量）
ü 質(zhì)譜法（定量）
三、靶向目標(biāo)基因的甲基化/去甲基化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
ü CRISPR-Cas9靶向編輯DNA甲基化實(shí)驗(yàn)：在細(xì)胞中人為表達(dá)目的基因，或通過(guò)CRISPR-Cas9系統(tǒng)靶向編輯DNA甲基化在目的基因上加上/擦除甲基化修飾。
ü 功能標(biāo)志物測(cè)定
ü ... ...
CRISPR-Cas9靶向編輯DNA甲基化技術(shù)
目標(biāo)區(qū)域DNA甲基化的驗(yàn)證手段——Target-BS（靶基因重亞硫酸鹽測(cè)序）
典型案例：
Target-BS用于甲基化多位點(diǎn)甲狀腺結(jié)節(jié)診斷
Target-BS發(fā)現(xiàn)食管鱗癌甲基化 biomarker
參考文獻(xiàn)：
① Targeted bisulfite sequencing identified a panel of DNA methylation-based biomarkers for esophageal squamous cell carcinoma (ESCC)，DOI 10.1186/s13148-017-0430-7
② Identification of Tissue-Specific DNA Methylation Signatures for Thyroid Nodule Diagnostics，DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-18-0841
③ Investigation of measurable residual disease in acute myeloid leukemia by DNA methylation patterns，doi.org/10.1038/s41375-021-01316-z
一、簡(jiǎn)單驗(yàn)證
- 目標(biāo)基因DNA甲基化的驗(yàn)證：Target-BS
- 檢測(cè)目標(biāo)基因的mRNA表達(dá)水平：RT-qPCR
- 檢測(cè)目標(biāo)基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平：Western blot
二、全基因組甲基化干擾實(shí)驗(yàn)（非靶向）
- DNA甲基化干擾：
ü DNA甲基化抑制劑
阿扎胞苷（5-Aza）能夠通過(guò)與DNA甲基化酶DNMT蛋白家族形成共價(jià)鍵抑制其酶活性，使細(xì)胞的DNA甲基化水平降低。
- 檢測(cè)整體DNA甲基化變化：
ü DNA斑點(diǎn)雜交（定性）
ü 比色法（定量）
ü 質(zhì)譜法（定量）
- 檢測(cè)目標(biāo)基因的DNA甲基化變化：Target-BS
- 檢測(cè)目標(biāo)基因的mRNA表達(dá)水平：RT-qPCR
- 檢測(cè)目標(biāo)基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平：Western blot
三、靶向目標(biāo)基因的甲基化/去甲基化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
- 目的基因DNA甲基化的干擾：
ü CRISPR-Cas9靶向編輯DNA甲基化實(shí)驗(yàn)：在細(xì)胞中人為表達(dá)目的基因，或通過(guò)CRISPR-Cas9系統(tǒng)靶向編輯DNA甲基化在目的基因上加上/擦除甲基化修飾。
- 檢測(cè)目標(biāo)基因的DNA甲基化變化：Target-BS
- 檢測(cè)目標(biāo)基因的mRNA表達(dá)水平：RT-qPCR
- 檢測(cè)目標(biāo)基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平：Western blot
- 檢測(cè)細(xì)胞功能受到的影響:
ü 功能標(biāo)志物測(cè)定
ü ... ...
CRISPR-Cas9靶向編輯DNA甲基化技術(shù)
目標(biāo)區(qū)域DNA甲基化的驗(yàn)證手段——Target-BS（靶基因重亞硫酸鹽測(cè)序）
- 靶向特定區(qū)域進(jìn)行超高深度甲基化測(cè)序。
- 超高深度：可達(dá)幾百到幾千乘。
- 單個(gè)區(qū)域長(zhǎng)度<300bp
- 需要設(shè)計(jì)BS引物，進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。
- WGBS vs. TBS相當(dāng)于RNA-seq vs. RT-qPCR
典型案例：
Target-BS用于甲基化多位點(diǎn)甲狀腺結(jié)節(jié)診斷
Target-BS發(fā)現(xiàn)食管鱗癌甲基化 biomarker
參考文獻(xiàn)：
① Targeted bisulfite sequencing identified a panel of DNA methylation-based biomarkers for esophageal squamous cell carcinoma (ESCC)，DOI 10.1186/s13148-017-0430-7
② Identification of Tissue-Specific DNA Methylation Signatures for Thyroid Nodule Diagnostics，DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-18-0841
③ Investigation of measurable residual disease in acute myeloid leukemia by DNA methylation patterns，doi.org/10.1038/s41375-021-01316-z
標(biāo)簽：
DNA甲基化
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